抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定办法

  参考文献：李合生主编：植物生理生化试验原理和技能.高等教育出版社，2000：267～268。

  （1）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。汲取样品提取液1.0Ml，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，参加5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充沛混合，放置2Min后在595nM下比色，记载吸光值，并经过规范曲线查得蛋白质含量。调零管是用蒸馏水

  称取1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。

  取试管3支，一支取3ml反响液并参加磷酸缓冲液1ml作调零，两支取3ml反响液并参加1ml酶液，当即计时，在470nm测定，酶隔30s读书一次。测一个样加一个，不要悉数加上。（边加样边测定，测定前等候5秒，动作要快，假如慢的话，要确保每个样品从加好样到开端记时的时刻相差不大）

  2.测定：取10ml试管3支，其间2支为样品测定管，1支为空白管（参加酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后参加H2O2测定吸光值），按表40-2次序参加试剂。

  （2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不明白。托付

  （4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍

  （2）反响液制造：汲取5.68ml30%的H2O2（原液）稀释至1000ml，摇匀即可。

  （3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物安排0.5g置研钵中，参加2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少数石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲刷研钵数次，兼并冲刷液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4℃冰箱中静置10min，取上部弄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用.

  称取剪碎的试材1g，参加2ml 10％TCA和少数石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心（4000r）离心10min，上清液为样品提取液。

  3.显色反响和测定汲取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），参加2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反响15min，敏捷冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。

  25℃预热后,逐管参加0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管当即记时，并敏捷倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管悉数测定完后，按下式核算酶活性。

  （1）考马斯亮蓝溶液制造：称取0.001g考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，参加100 ml 85％（W/V）的磷酸（不明白），85%是磷酸的质量分数，买回来时直接便是85%的磷酸，参加100ml就行。再用蒸馏水定容到1Ｌ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。

  SOD活性测定与核算至反响完毕后，以不照光的作空白，别离测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以按捺NBT光化复原的50%为一个酶活性单位表明。按下式核算SOD活性：

  式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表明；比生机单位以酶单位/mg蛋白表明；

  取50ml PBS(100mmM，pH6.0)，参加28ul愈创木酚（2-甲氧基酚）加热拌和溶解，冷却后参加19ul 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

  酶液制备：取必定部位的植物叶片（视需求定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

  用上述任一办法求得MDA的浓度，依据植物安排的分量核算测定样品中MDA的含量：

  （4）酶活性核算：以每min OD值改变（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

  ΔA470：为反响时刻内吸光度的改变；W为样品鲜重(g)；t为反响时刻(min)；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时取用酶液体积。

  2．显色反响取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对看管，别的1支作为空白，按表39-1参加各溶液。

  混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反响20min（要求各管受光状况共同，反响室的温度高时时刻可适当缩短，温度低时时刻可适当延伸）。