过氧化氢酶（CAT）活性的 测定办法

  过氧化氢酶（catalase，CAT）都会存在于植物安排中，是重要的维护酶之一，其效果是铲除代谢中发生的H堆集对细胞的氧化损坏效果，因而其活性的凹凸与植物的抗逆性有关。本文将会介绍两种测定过氧化氢酶活性测定的办法，即紫外吸收法和碘量滴定法的原理、试验过程和注意事项。

  H2O2对240nm波长的紫外光具有强吸收效果，CAT能催化H2O2分化成H2O和O2，因而在反响系统中参加CAT时会使反响液的吸光度（A240）随反响时刻下降，依据A240的改变速率可核算出CAT的活性。

  （1）酶液的提取：称剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置于预冷的研钵中，加适量磷酸缓冲液及少数石英砂，在冰浴上研磨匀浆，转移至10 ml量瓶中，用磷酸缓冲液冲刷研钵2-3次（每次1-2ml），兼并冲刷液于量瓶中，定容至10ml，摇匀。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。

  ②取10ml 试管4支，3支为测定（3个重复），1支为对照，按下表参加试剂：

  ③将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后，逐管参加0.2ml 200 mmol·L-1H2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度计上测定A240(蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min，记载4支试管的测定值。

  （3）成果核算：以1 min内A240下降0.1（3支测定管的平均值）为一个酶活性单位（U），先求出3支测定管各自1min内A240下降值，按下式核算CAT活性。

  式中，△A240=As0-(As1+As2+As3)/3;As0:煮死酶液对看管吸光度；As1、As2、As3：样品测定管吸光度；Vt：酶提取液总体积(ml);Vs:测守时取酶液的体积（ml）；FW：样品鲜重（g）

  CAT能催化H2O2分化成H2O和O2，其活性巨细以一段时刻内分化H2O2的量来表明。当反响系统中有过量H2O2存在时，酶与底物（H2O2）反响完毕后，用碘量滴定法测定剩下的H2O2。其测定原理是：在钼酸铵催化下，H2O2与KI反响，放出游离I2，然后用Na2S2O3滴定碘。

  (3)1%淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，于小烧杯顶用20mL水调匀，缓慢参加80mL沸水中，拌和下加热至欢腾，冷却后贮于滴瓶中。

  标定办法：精确称取K2Cr207(剖析纯）0.1500 g于500 mL三角瓶中，加30 mL蒸馏水溶解，加2g KI和5mL 6 mol•L-1HCl，私自放置5 min后用蒸馏水定量至200 mL,用上述 0.05 mol•L-1的Na2S2O3溶液滴定，当溶液由棕赤色改变至淡黄色时参加1 mL 1%淀粉溶液, 持续滴定至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr离子的色彩〉停止，核算出Na2S2O3溶液的切当浓度。

  （1）酶液的提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.0 g置于研钵中，加0.2 g CaCO3粉 末和2 mL蒸馏水研磨匀浆，移入量瓶中定容至100 mL，摇匀，静置，取上清液10 mL移入100 mL 量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。

  （2）CAT活性测定：取100 mL三角瓶6个，编号，向各瓶中各参加稀释后的酶液10 mL，一起给4、5、6号瓶中各加5 mL 1.8 mol•L-1H2SO4，停止酶活性，作为空白对照。将6个三角瓶置于20 ℃恒温水浴中保温5min,向各瓶中精确参加5 mL 0. 2 mol•L-1H2O2溶液，记载参加的时刻，摇匀后20℃水浴中保温，让酶效果5min后，顺次向1、2、3号瓶中各加5 ml 1.8 mol•L-1H2SO4停止酶活性。然后向各瓶中加1mL20% KI，3滴钼酸铵溶液及5滴1%淀粉指示剂，用 0.01 mol•L-1Na2S2O3标准溶液滴定至蓝色消失，记载滴定数据。

  （3）紫外分光光度法进行比色测守时，要尽或许测定反响的初速度，因而H2O2溶液参加后应立即进行比色读数。